Skip to content

Ukierunkowana ekspresja dominującego negatywnego EGF-R w nerkach zmniejsza uszkodzenia kanalikowo-śródmiąższowe po uszkodzeniu nerek czesc 4

2 miesiące ago

692 words

Stopień akumulacji kolagenu określono przy użyciu tej samej skali na odcinkach barwionych czerwienią Sirius, przez zsumowanie 20 losowo wybranych pól mikroskopowych na nerkę (x 400). Liczbę zarodków na odcinek rurowy zliczono na odcinkach wybarwionych PAS. Sto cewek proksymalnych na nerkę analizowano w losowo wybranym polu mikroskopowym (× 400). Immunohistochemia. Ludzkie znakowanie immunologiczne EGF-R przeprowadzono na zamrożonych skrawkach tkanek. Skrawki o grubości pięciu mikrometrów inkubowano przez godzinę w 4 ° C z mysim monoklonalnym przeciwciałem przeciw ludzkiemu EGF-R (GR01, Calbiochem, Cambridge, Wielka Brytania), które specyficznie rozpoznaje zewnątrzkomórkową domenę EGF-R, rozcieńczoną 1:10. , a następnie utrwalono w 4% lodowatej formalinie w 4 ° C przez 5 minut. Związane pierwotne przeciwciało wykrywano biotynylowanym kozim anty-mysim IgG (DAKO, Trappes, Francja), a następnie układem awidyna / biotyna / peroksydaza (zestaw LSAB; DAKO). Następnie jako chromogen stosowano 3-amino-9-etylokarbazol (AEC, DAKO), a skrawki barwiono kontrastowo hemulowym Meyer i osadzano w żelatynie glicerynowej (Merck, Nogent-sur-Marne, Francja). Kontrole negatywne uzyskano zastępując określone surowice odpornościowe surowicami nieimmunologicznymi i barwiąc skrawki nerkowe myszy typu dzikiego konkretnymi surowicami odpornościowymi. Eksperymentowanie jądrowego antygenu jądrowego komórek (PCNA) przeprowadzono na tkankach zatopionych w parafinie, jak opisano wcześniej (34). Liczbę jąder wyznakowanych PCNA określono w 20 losowo wybranych polach mikroskopowych przemieszczających się z zewnętrznej do głębokiej kory (x 200). Czynność nerek. Czynność nerek oceniano na myszach transgenicznych i dzikich w różnych okresach po urodzeniu, od do 18 miesięcy. Próbki moczu zebrano za pomocą klatek metabolicznych Tecniplast w ciągu 24 godzin i próbki krwi uzyskano przez nakłucie cava po pobraniu moczu. Stężenie kreatyniny, mocznika i elektrolitu w osoczu oznaczano za pomocą wielomiarkowego autoanalizatora Monarch (Laboration Laboratory, Paryż, Francja). Ćwiczenia rurowe. Aktywności 5a-nukleotydazy (5a-nuc), .-glutamylo-transpeptydazy (a-GTT) i Na-K-ATP-azy oznaczono jak opisano wcześniej (37). Ekspresja danych i analiza statystyczna. Dane wyrażono jako średnie plus lub minus SEM. Różnice między grupami eksperymentalnymi oceniano stosując jednoczynnikową ANOVA, a następnie, gdy było to istotne, test Bonferroniego. Wyniki Generowanie transgenicznych myszy. GT-EGF-RM. Myszy transgeniczne eksprymujące EGF-RM pod kontrolą promotora typu. GT wytworzono przez mikroiniekcję mysich zygot C57BL / 6 x DAB2 za pomocą konstruktu transgenu. Trzech założycieli (Fo-8, Fo-20 i Fo-35) zidentyfikowano za pomocą analizy Southern tail DNA. Trawienie genomowego DNA BamH1 przez transgeniczne myszy uwolniło przewidywany transgen o masie 5,0 kb, który został zintegrowany z wieloma kopiami w układzie głowa do ogona , co wykryto przez hybrydyzację z ludzką specyficzną dla transgenu ludzką siatką (A) p-globiny. Linia 20, wyrażająca najwyższy poziom transgenu, została wybrana do dalszej analizy. Specyficzna tkankowo ekspresja transgenu. GT-EGF-RM. Ekspresję transgenu badano za pomocą analizy Northern blot RNA z transgenicznych mysich tkanek przy użyciu specyficznej dla transgenu ludzkiej s-polioli (A). Transkrypt o wielkości 3,0 kb był przewidywanej wielkości dla transgenu i został wykryty w nerkach, ale nie w wątrobie, śledzionie, sercu, jądrze, mózgu i jelicie (Figura 1a). Figura Ekspresja transgeniczna i funkcja u myszy transgenicznych. (a) Analiza Northern blot. Transgen wykrywano wyłącznie w nerkach, stosując ludzką sondę poli (A) p-globiny. (b) Analiza immunohistochemiczna specyficznym przeciwciałem przeciw ludzkiemu EGF-R. Transgen zlokalizowany był w boczno-bocznych błonach proksymalnych transgenicznych kanalików (EGF-RM, środkowy panel), ale nie w tych w membranach typu dzikiego (WT, lewy panel). Specyficzne wybarwienie wykrywano w korze (C), ale nie w rdzeniu (M) myszy transgenicznych (prawy panel). (c) Analiza Western blot mysich (m-EGF-R) i ludzkich (h-EGF-R) receptorów EGF w proksymalnych komórkach rurkowych z myszy WT i EGF-RM. Podobne ilości endogennego EGF-R wykryto przez specyficzne przeciwciało wewnątrzkomórkowe domeny anty-EGF-R u myszy EGF-RM i WT (m-EGF-R), podczas gdy stwierdzono białko o masie 110 kDa, odpowiadające skróconemu receptorowi. w transgenicznym, ale nie u myszy typu dzikiego, przez specyficzne przeciwciało przeciw ludzkiemu EGF-R (h-EGF-R). Komórki A431 nadeksprymujące ludzki endogenny EGF-R (h-EGF-R, 170 kDa) zastosowano jako kontrolę pozytywną. Dystrybucję białka EGF-RM oceniano w nerkach zwierząt transgenicznych i dzikich za pomocą immunohistochemii, stosując monoklonalne przeciwciało przeciw ludzkiemu EGF-R, które jest specyficzne dla ludzkiego receptora i nie reaguje krzyżowo z reakcją myszy.
[więcej w: kalendarzyk miesiączkowy ob, crt d, crt kardiologia ]
[podobne: badania elektrofizjologiczne, crt p, kalendarzyk miesiączkowy ob ]