Skip to content

Ukierunkowana ekspresja dominującego negatywnego EGF-R w nerkach zmniejsza uszkodzenia kanalikowo-śródmiąższowe po uszkodzeniu nerek cd

1 miesiąc ago

646 words

Immunoprecypitaty rozdzielono na żelach 7% SDS-poliakryloamidowych i przeniesiono na membranę nitrocelulozową (Biorad, Ivry sur Seine, Francja). Błonę inkubowano z rekombinowanym przeciwciałem przeciw fosfotyrozynie połączonym z peroksydazą chrzanową (RC20, Transduction Laboratories, Interchim, Montlucon, Francja), rozcieńczonym 1: 2500. Immunoreaktywne białka wykrywano przez wzmocnioną chemiluminescencję (ECL, Amersham Pharmacia Biotech, Courtaboeuf, Francja). Filmy skanowano przy użyciu skanera Scan-Jet 3c / ADF (Hewlett Packard, Palo Alto, Kalifornia, USA) i sygnały określano ilościowo przy użyciu oprogramowania do obrazowania NIH (Bethesda, Maryland, USA). Aby ocenić ekspresję endogennego i zmutowanego EGF-R, białka ekstrahowano z hodowanych proksymalnych komórek cylindrycznych (35), rozdzielono w żelach 7% SDS-poliakryloamidowych i przeniesiono na błonę nitrocelulozową. Membranę inkubowano, najpierw, z przeciwciałem mAb 108 (dostarczonym przez A. Ullrich), które specyficznie rozpoznaje zewnątrzkomórkową domenę ludzkiego EGF-R, rozcieńczoną 1: 2000, a następnie poliklonalnym Ab-22 (patrz powyżej). , rozcieńczony 1: 2000. Immunoreaktywne białka zostały wykryte przez przeciwciało anty-mysie i przez przeciwciało anty-królicze rozcieńczone 1: 4000, a następnie ECL. Analiza Northern blot. Całkowity RNA ekstrahowano z nerek przy użyciu zestawu RNAzol (Bioprobe, Montreuil-sous-Bois, Francja). RNA frakcjonowano na 1% żelu agarozo-formaldehydowym i przeniesiono na membranę nylonową (Zetabind, CUNO Inc., Meridien, Connecticut, USA). Prehybrydyzację, hybrydyzację i przemywanie przeprowadzono zgodnie z zaleceniami producenta. RNA określono ilościowo za pomocą Packard Instant Imager. Sondy cDNA znakowano losową metodą primingu (Amersham Pharmacia Biotech) przy użyciu alfa 32P-dCTP. MRNA EGF-RM wykryto z całym cDNA ludzkiej globiny o długości 1,2 kb (A), jak opisano w Southern biot. Barwienie bromkiem etydyny 18S i 28S stosowano w celu ilościowego oznaczenia obciążenia RNA na żelu i porównania intensywności hybrydyzacji uzyskanej w różnych ścieżkach. Doświadczenia wiązania 125I-EGF. Proksymalne kanaliki wyizolowano z nerek myszy transgenicznych i typu dzikiego. W skrócie, nerki usunięto, odkapkowano i rozdrobniono w temperaturze 4 ° C pod ciśnieniem (homogenizator Dounce nr 7, Poly Labs, Strasbourg, Francja) w HBSS. Próżniowe kanaliki rozdzielano przez filtrowanie na nylonowej siatce (106 .m) i ponownie zawieszano w PBS zawierającym 0,1% BSA (PBS / BSA). Przeprowadzono wstępne doświadczenia w celu określenia optymalnych warunków wiązania pod względem stężenia białka i czasu inkubacji. Równoważne ilości kanalików (odpowiadające 300 .g białek) inkubowano przez 4 godziny w 4 ° C ze wzrastającymi stężeniami (od 0,01 do 10 nM) 125I-EGF (Amersham Pharmacia Biotech) z 1000-krotnym nadmiarem nieznakowanego i bez niego EFG. Po inkubacji kanaliki odwirowano, przemyto PBS / BSA, a radioaktywność zmierzono w liczniku gamma. Niespecyficzne wiązanie odjęto od całkowitej liczby w każdym punkcie stężenia, aby uzyskać specyficzne wiązanie. Morfologia nerek. Nieoperowane nerki z transgenicznych i dopasowanych pod względem płci i wieku myszy typu dzikiego, usuwane w różnym czasie po urodzeniu (1. 18 miesięcy), jak również nerki myszy, które przeszły różne modele uszkodzenia nerek (patrz powyżej), zostały 4% formalina na noc, odwodniona etanolem i zatopiona w parafinie. Skrawki o grubości czterech mikrometrów wybarwiono kwasem nadjodowym Schiff (PAS), z trichromem Massona i czerwonym Syriuszem. Wszystkie sekcje zostały ocenione przez patologa, który nie był świadomy badanej grupy. Opracowano półilościową ocenę w celu oceny stopnia uszkodzenia po urazie nerek, zgodnie z ustaloną metodologią (36). Po częściowej nefrektomii określono stopień uszkodzenia kanalików na skrawkach wybarwionych PAS, oceniając 100 proksymalnych kanalików na nerkę w losowo wybranych polach mikroskopowych (× 400). Zmiany rurek cylindrycznych były stopniowane od 0 do 3+, w zależności od nasilenia rozszerzalności rurkowej. Po przedłużonym niedokrwieniu nerek, stopień uszkodzenia kanalikowo-śródmiąższowego (składający się z co najmniej jednego z następujących: atrofia cewkowa, zwłóknienie śródmiąższowe, naciekanie komórek śródmiąższowych) oznaczono na przekrojonych fragmentach trichromu Massona, przez zsumowanie 20 losowo wybranych pól mikroskopowych na nerkę (× 400), stosując skalę obrażeń 0. 4+. Skala Uszkodzeń 0 oznacza brak uszkodzeń kanalikowo-śródmiąższowych, podczas gdy 1, 2, 3 i 4 odpowiadają odpowiednio 1, 10, 11. 25, 26. 50 i 51. 100% zaangażowania pola mikroskopowego
[patrz też: kardiolog blog, wiarygodny test internetu, crt p ]
[hasła pokrewne: crt kardiologia, badanie elektrofizjologiczne serca, kardiolog blog ]