Skip to content

Ukierunkowana ekspresja dominującego negatywnego EGF-R w nerkach zmniejsza uszkodzenia kanalikowo-śródmiąższowe po uszkodzeniu nerek ad

1 miesiąc ago

722 words

Z tych powodów opracowaliśmy strategię dominującą negatywną EGF-R, opartą na ukierunkowanej ekspresji receptora skróconego COOH (HERCD-533) w nerkach za pomocą 5. region regulatorowy genu. -lutamylo-transpeptydazy typu (. GT-1). Wybraliśmy ten promotor w celu ukierunkowania na proksymalne komórki kanalikowe, które są głównym miejscem wiązania EGF w nerkach (5) oraz w celu uniknięcia wad rozwojowych nerek (gen (3-GT-1 jest głównie wyrażany 3 tygodnie po urodzeniu; ). Następnie badaliśmy wpływ ekspresji transgenu na rozwój zmian nerek w dwóch różnych modelach uszkodzenia nerek: subtotalnej nefrektomii i przedłużonego niedokrwienia nerek. Stwierdziliśmy, że w warunkach kontrolnych transgeniczne myszy miały prawidłową morfologię nerek i funkcję nerek. Jednak po uszkodzeniu nerek homozygotyczne myszy transgeniczne były oporne na rozwój zmian nerek. Te odkrycia pokazały kluczową rolę sygnalizacji EGF-R w procesie niszczenia nerek i dowiodły potencjału terapeutycznego zastosowania mutantów EGF-R w leczeniu progresji przewlekłej niewydolności nerek. Metody Konstrukcja plazmidu i generowanie myszy transgenicznych. Aby wytworzyć gen fuzyjny a-GT-EGF-RM, promotor. GT usunięto z plazmidu pG2.2rasT24 (dostarczonego przez MW Lieberman, Department of Pathology, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, USA) i sklonowano do Plazmid pBluescript, generujący plazmid. GT. Zmutowany EGF-R (HERCD-533) usunięto z plazmidu Prk5HerNA8 (uprzejmie dostarczonego przez A. Ullrich, Wydział Biologii Molekularnej, Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried, Niemcy) i poddano ligacji z plazmidem. GT trawionym XbaI. . Na koniec fragment 1,2-kb, zawierający sekwencję poli (A) dla genu ludzkiej globiny, wyizolowano i sklonowano w plazmidzie .-GT-EGF-RM. Transgen wycięto z plazmidu p-GT-EGF-RM za pomocą Pvul i XhoI i poddano mikroiniekcji do przedjądrza zapłodnionych jednojądrowych jaja C57BL / 6 x DAB2 F1. Transgeniczne myszy zidentyfikowano za pomocą analizy typu Southerna przy użyciu fragmentu XbaI / XhoI znakowanego 32P, odpowiadającego poli (A) ludzkiemu genowi globiny. Linia 8, 20 i 35 zostały ustalone i utrzymywane przez hodowlę dla hybrydowych zwierząt C57BL / 6 x DAB2 F1. Wszystkie procedury dotyczące zwierząt przeprowadzono zgodnie z polityką rządu francuskiego (Service Vétérinaire de la Santé et de la Production Animale, Minist. Re de l . Agriculture). Eksperymentalne modele uszkodzenia nerek. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na dorosłych (2 do 3 miesięcy) homozygotycznych myszach transgenicznych (EGF-RM) i na zwierzętach dzikich typu dopasowanych do wieku i płci. Homozygotyczne transgeniczne myszy uzyskano przez homozygotyczne krzyżówki EGF-RM, podczas gdy myszy typu dzikiego uzyskano przez hodowlę hybrydowych zwierząt C57BL / 6 x DAB2 F1. Krzyże zostały wykonane równolegle w tym samym obiekcie dla zwierząt. Nałożenie częściowe nefrektomii. Częściowa nefrektomia (Nx, 75% wycięcie całkowitej masy nerkowej) została przeprowadzona, jak opisano wcześniej (32) na 18 myszach transgenicznych i 18 myszach typu dzikiego. Myszy kontrolne (n = 9 w każdej grupie) poddano operacji pozorowanej z de- klapsacją obu nerek. Początkowo badanie zaplanowano na 2 miesiące po operacji, w punkcie czasowym, w którym reszta nerki wykazała ciężkie zmiany w nerkach, przynajmniej u szczurów (33). Ponieważ morfologia pozostałych nerki ujawniła dobrze zachowaną tkankę nerkową u myszy typu dzikiego i transgenicznych w tym czasie (n = 5 dla każdej grupy), jak również po 6 miesiącach (n = 5 dla każdej grupy), myszy (n = 8 dla każdej grupy) musiało zostać poświęcone 8 miesięcy po operacji. Długotrwałe niedokrwienie nerek. Przedłużone niedokrwienie nerek (PRI; 50-minutowe zaciskanie lewej łódki nerek) przeprowadzono jak opisano wcześniej (34). Myszy uśmiercono 2, 4, 7, 14 i 28 dni po operacji. Za każdym razem badano sześć transgenicznych i sześć dzikich zwierząt. Aby określić szybkość proliferacji komórkowej w normalnej nerce, zbadano pięć normalnych myszy myszy transgenicznych i dzikich nieoperowanych. Fosforylacja EGF-R. Dorosłe (2 miesiące) myszy transgeniczne i typu dzikiego poddano iniekcjom dosercowym EGF (1 .g / g masy ciała) w izotonicznym roztworze soli. Po 10 lub 20 minutach myszy uśmiercono, a nerki usunięto i homogenizowano w buforze zawierającym 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, mM. ortowanadan sodu, 10 .g / ml pepstatyny A, 10 .g / ml leupeptyny, 2 .g / ml aprotyniny i 100 .g / ml PMSF. Nerki od normalnie nieincjowanych transgenicznych i dzikich myszy były również przygotowane do oceny podstawowego poziomu fosforylacji EGF-R. Analiza Western blot. W celu analizy fosforylacji białka EGF-R, równoważne ilości białek poddano immunoprecypitacji za pomocą króliczego przeciwciała poliklonalnego anty-EGF-R (Ab-22, dostarczone przez E
[przypisy: nakładanie żelu na paznokcie, psychoterapia na czym polega, outlet szczecin godziny otwarcia ]
[podobne: maseczka z siemienia lnianego na włosy, badanie elektrofizjologiczne, crt d ]