Skip to content

Ukierunkowana ekspresja dominującego negatywnego EGF-R w nerkach zmniejsza uszkodzenia kanalikowo-śródmiąższowe po uszkodzeniu nerek ad 5

1 miesiąc ago

465 words

Zgodnie z oczekiwaniami immunoreaktywność EGF-RM nie mogła zostać ujawniona w żadnej strukturze nerek ze zwierząt dzikich (Rysunek 1b, lewy panel). Przeciwnie, białko EGF-RM wykryto w proksymalnych kanalikach transgenicznych myszy (Figura 1b, środkowy panel). Barwienie ograniczono do boczno-bocznych błon komórkowych i było bardziej intensywne w kanalikach zlokalizowanych w głębokiej korze (Figura 1b, prawy panel). W kłębuszkach, naczyniach i dystalnych kanalikach nie zaobserwowano specyficznego zabarwienia. W proksymalnych komórkach kanalików z myszy transgenicznych, ale nie z myszy typu dzikiego, wykryto białko o masie 110 kDa metodą Western blot ze specyficznym przeciwciałem przeciwko ludzkiemu EGF-R odpowiadającym transgenowi (Figura 1c, dolny panel). Przy użyciu specyficznego przeciwciała wewnątrzkomórkowego domeny anty-EGF-R, analiza Western blot wykazała, że ilość endogennego EGF-R była podobna w komórkach ze zwierząt transgenicznych i dzikich (Figura 1c, górny panel). Hamowanie funkcji EGF-R. Następnie analizowaliśmy autofosforylację EGF-R w nerkach myszy typu dzikiego i transgenicznych, 10 i 20 minut po wstrzyknięciu dosercowym EGF. U myszy typu dzikiego, wstrzyknięcie EGF spowodowało fosforylację nerkowego EGF-R, odpowiadającego pasmu 170 kDa (Figura 2a). Efekt był bardziej intensywny po 10 minutach niż po 20 minutach. U myszy transgenicznych indukowana przez EGF fosforylacja endogennego EGF-R była silnie zmniejszona w porównaniu ze zwierzętami typu dzikiego w dowolnym punkcie czasowym (Figura 2, aib). Ryc. 2 Funkcja translacji. (aib) Analiza Western błot autofosforylacji EGF-R u myszy transgenicznych (EGF-RM) i dzikich (WT). (a) Ekspresja transgenu zmniejszyła fosforylację EGF-R u myszy transgenicznych po wstrzyknięciu EGF. Białka ekstrahowano z całej nerki i immunoprecypitowano przeciwciałem anty-EGF-R. Immunoprecypitat sondowano przeciwciałem anty-fosfotyrozynowym RC-20. (b) Zwiększenie ilości (50, 100, 200 i 300 .g) białek poddano immunoprecypitacji w celu walidacji metody stosowanej do ilościowego oznaczania fosforylacji EGF-R (regresja liniowa: r2 = 1,00 i 0,985 dla myszy typu dzikiego i transgenicznych, odpowiednio; ). (c) Krzywe wiązania i wykresy Scatcharda (wstawka) wiązania 125I-EGF. Ekspresja transgenu zniosła stan wysokiego powinowactwa endogennego receptora w izolowanych kanalikach proksymalnych. Zwróć uwagę, że w dwóch wypustkach zastosowano różne skale. Ponieważ poprzednie prace (38) donoszą, że transfekcja EGF-RM w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO) zniosła stan wysokiego powinowactwa receptora typu dzikiego, przeanalizowaliśmy wiązanie 125I-EGF w proksymalnych kanalikach izolowanych z dziczy i zwierzęta transgeniczne. Analiza Scatcharda danych wiązania (Figura 2c) wskazała, że w kanalikach typu dzikiego EGF-R wykazywał dwie klasy miejsc wiązania: około 10% miejsc (8,5. 0,2 fmol / mg białka) wykazywało wysokie powinowactwo do liganda z Wartość Kd wynosi 0,4 x 10 A 9 M, pozostałe miejsca wiązania (białko 83. 2,3 fmol / mg) wykazują niskie powinowactwo z wartością Kd 3,1 x 10. 9 M. W proksymalnych kanalikach myszy transgenicznych odsetek Miejsca wiązania powinowactwa zostały zredukowane, podczas gdy liczba miejsc wiązania o niskim powinowactwie (wartość Kd 3 x 10 ~ 9 M) była znacznie zwiększona (267. 4,4, P <0,001). Konsekwencje ekspresji transgenu a-GT-EGF-RM na morfologię i funkcję nerek. U myszy transgenicznych, nerkowa struktura kłębuszkowa i rurkowa była prawidłowa (Figura 3b), porównywalna w warunkach podstawowych do stanu zwierząt dzikich (Figura 3a). Stężenia osoczowe kreatyniny, mocznika, sodu, potasu, chlorków, wapnia i fosforu, oceniane między a 18 miesiącem po urodzeniu, były porównywalne w zwierzętach transgenicznych i dzikich w dowolnym punkcie czasowym (dane nie pokazane). Klirens kreatyniny był podobny w dwóch grupach eksperymentalnych i wynosił około 0,12 ml / min po 12 miesiącach od urodzenia. Figura 3: Morfologia operowanych pozornie (aib) i resztkowych nerek (cid) u myszy typu dzikiego (a i c) i transgenicznych (b i d), 8 miesięcy po operacji. Zmniejszenie Nefronu wywołało kilka zmian morfologicznych kanalików proksymalnych (porównaj c z aib), którym zapobiegła ekspresja transgenu (porównaj d z c). Barwienie PAS, × 200. Ponieważ doniesiono, że EGF może modulować funkcję rurkową (39), następnie badaliśmy wpływ ekspresji transgenu na funkcje rurowe transportu, enzymatyczne i pompy. Ekspresja EGF-RM nie wpływała na zdolność proksymalnych kanalików do ponownego wchłonięcia substancji rozpuszczonych (Tabela 1). Podobnie, aktywność 5 (3-nukleotydazy i (3-GT, dwóch enzymów proksymalnych cylindrycznych membran szczotkowych granicznych, jak również enzymu Na-K-ATPazy, pompy membran basolateralnych, były porównywalne w transgenicznych i typu dzikiego myszy (tabela 1). Tabela Czynność białkowa u myszy typu dzikiego i transgenicznych Progresja zmian w nerkach była zmniejszona u myszy transgenicznych EGF-RM [patrz też: ciasta bezglutenowe przepisy, kardiolog blog, peeling kawitacyjny przeciwwskazania ] [patrz też: przeciwwskazania do mikrodermabrazji, diukowie hazzardu cda, outlet szczecin godziny otwarcia ]