Skip to content

Transkrypcyjny czynnik pośredniczący 1 jest supresorem guza u myszy i u ludzi przewlekłej białaczki mielomonocytowej ad 8

1 miesiąc ago

678 words

cDNA uzyskano z całkowitego RNA 150 ng przy użyciu odwrotnej transkryptazy M-MLV (Promega). Real-time Q-PCR (RQ-PCR) przeprowadzono w trzech powtórzeniach z użyciem sond TaąMan (Applied Biosystems) i analizowano w systemie PCR Real-Time Applied Biosystems 7500. Test Tif1g TaqMan był Mm01308706_m1. Wartości dla każdej PCR zostały znormalizowane do poziomów Hprt (Mm03024075_m1). W celu zbadania ekspresji Csf1r, Csf3r i Csf2ra przeprowadzono PCR w czasie rzeczywistym w termocyklerze 7500 FAST (Applied Biosystems) z zastosowaniem protokołu wykrywania SYBR Green, jak nakreślono przez producenta. Specyficzne dla myszy startery do przodu i do tyłu były: Csf1r, 5. -CATGGCCTTCCTTGCTTCTAAA-3. i 5-CAGCACGTTTCGAGCTGCTA-3; Csf3r, 5. -GCGCCGACTGTCAGTACCA-3. i 5. -GGAGCAGTTGTTCTGCCTCTTC-3 .; i Csf2ra, 5. -ACGTGGCGCGATGCAT-3. i 5a-TCACGACCAAGTAGGCCTCACT-3 .. Hprt został użyty jako kontrola wewnętrzna. Pobieranie i analiza CMML. Pobrano próbki krwi od pacjentów z CMML i uzyskano świadomą zgodę. Badania tkanki CMML zostały sprawdzone i zatwierdzone przez komisję ds. Przeglądu w szpitalu w Cochin (Paryż, Francja). Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej izolowano za pomocą Ficoll Hypaque (Eurobio), a monocyty sortowano przy użyciu zestawu do izolacji magnetycznej CD14 + i separatora AutoMACS zgodnie z instrukcjami producenta (Miltenyi Biotec). Całkowity RNA wyizolowano przy użyciu odczynnika TRIzol (Invitrogen) zgodnie z instrukcjami producenta. RNA poddano odwrotnej transkrypcji przez odwrotną transkryptazę M-MLV z losowymi starterami heksamerowymi (Promega). Real-time PCR przeprowadzono z użyciem polimerazy AmpliTaq Gold w termocyklerze 7500 FAST (Applied Biosystems) z zastosowaniem protokołu wykrywania SYBR Green, jak nakreślono przez producenta. W skrócie, użyto 15 ng całkowitego komplementarnego DNA, 50 nM każdego startera i × SYBR Green mix w całkowitej objętości 20 ul. Ludzkie specyficzne startery do przodu i do tyłu były L32, 5a-TGTCCTGAATGTGGTCACCTGA-3. i 5. -CTGCAGTCTCCTTGCACACCT-3. stosowany jako kontrola standaryzująca, TIF1G, 5. -AGCAACGGCGACATCCA-3. i 5a-TGCATTCTTGGCGGCATA-3a i CSF1R, 5a-GCCCCCCATCACCTCACT-3. i 5-GTGTTTTGGAAGGTAGCGTTGTT-3 .. L32 zastosowano jako kontrolę wewnętrzną. Leczenie CMML za pomocą decytabiny. Dorośli z rozpoznaniem CMML zostali włączeni do. Fazy II badania decytabiny u pacjentów z przewlekłą białaczką mielomonocytową. (GFM-DEC-LMMC-2007-02) i uzyskano świadomą zgodę. Badania tkanek CMML zostały sprawdzone i zatwierdzone przez instytucyjną komisję recenzyjną Hospital Cochin. Wyizolowano monocyty, jak opisano w pobieraniu i analizie próbek CMML, po traktowaniu decytabiną i poddano analizie RQ-PCR. Jeden cykl decytabiny odpowiada 20 mg / m2 / dzień iv przez 5 dni co 22 dni. W hodowli in vitro monocyty izolowane od pacjentów z CMML hodowano w podłożu Glutamax RPMI 1640 (BioWhittaker) uzupełnionym 10% płodową surowicą cielęcą (BioWhittaker), penicyliną (100 U / ml), streptomycyną (100 ug / ml) i amfoterycyną. B (0,25 .g / ml) (BioWhittaker) w 37 ° C w wilgotnej atmosferze 5% CO2. Komórki wysiano w ilości 0,5 x 106 komórek / ml i inkubowano przez 3 dni z M-CSF (100 ng / ml) w obecności lub nieobecności decytabiny (3 (M). Obróbka i sekwencjonowanie Bisulfitu DNA. Genomowy DNA wyizolowano z monocytów pacjentów z CMML przed i po 7 cyklach decytabiny, stosując standardowe procedury QIAGEN. Dwieście nanogramów całkowitego genomowego DNA zmodyfikowano przez traktowanie wodorosiarczynem zgodnie z instrukcjami producenta (MethylDetector, Active Motif). Przekonwertowany promotor TIF1G zidentyfikowano przez PCR ze skonwertowanymi primerami do przodu (5a-GGCTTTAAAAAAAAAATCTCCCTT-3 .) i odwrotną (5a-CCACCATATTTTCCTCTTTAAACCCG-3a), a bezpośrednią reakcję sekwencjonowania przeprowadzono stosując warunki standardowe zgodnie z instrukcjami producenta (zastosowane). Biosystems). Procedura ChIP. Milion komórek utrwalono za pomocą 1% formaldehydu w celu usieciowania DNA białkami, a następnie poddano lizie i sonikacji. Procedurę ChIP przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta z modyfikacjami (Upstate Biotechnology) i jak opisano wcześniej (58). Po wstępnym oczyszczeniu z płytek agarozowych DNA / białko A / G spermy łososiowej, próbki poddano immunoprecypitacji z 3 .l przeciwciał specyficznych dla acetylowanego H2B K5, fosforylowanego H3 T11, acetylowanego H3 K27, fosforylowanego H3 Y41, metylowanego H3 K79, metylowanego H4. K20 (Santa Cruz Biotechnology Inc.), trimetylowany H3K4, trimetylowany H3K9, trimetylowany H3K27, acetylowany H3K9 K14, acetylowany H4K16 (Millipore) lub króliczej IgG (Santa Cruz Biotechnology Inc.) w 4 ° C przez noc. Kulki płukano, eluowano kompleksy białko / DNA, a następnie sieciowanie odwracano przez ogrzewanie w 65 ° C przez noc
[hasła pokrewne: crt p, diukowie hazzardu cda, kalendarzyk miesiączkowy ob ]
[hasła pokrewne: diukowie hazzardu cda, outlet szczecin godziny otwarcia, psychoterapia na czym polega ]