Skip to content

Transkrypcyjny czynnik pośredniczący 1 jest supresorem guza u myszy i u ludzi przewlekłej białaczki mielomonocytowej ad 7

2 miesiące ago

703 words

Do drugiego przeszczepu zastosowano ten sam protokół. W przypadku wzajemnych przeszczepień wstrzyknęliśmy w sumie 2 x 106 komórek BM od kontrolnych myszy-dawców do zatoki oczodołowej Tif1g. /. lub kontrolować letalnie napromienionego biorcę (16 Gy) myszy C57BL / 6. Analiza krwinek. Kontrola dorosłych i Tif1g. /. myszy znieczulono 1%> 2% izofluranu. Krew pobierano z żyły spojówki oka za pomocą rurki powlekanej EDTA. Pełną morfologię krwi wykonano za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego (MS Laboratories). Pobraną krew wykorzystano również do przygotowania rozmazów krwi, które zostały zabarwione plamą May-Grünwald-Giemsa (MGG). Przygotowanie komórki. Po uśmierceniu myszy badano na obecność nieprawidłowości, a narządy pobierano do dalszych analiz komórkowych i histopatologicznych. W przypadku preparatów z komórkami szpiku kostnego kości udowe i piszczelowe usunięto aseptycznie i komórki przepłukano. W przypadku splenocytów śledziony zostały rozcięte, czerwone krwinki zostały zlizowane, a komórki zostały przemyte x PBS (Lonza). Reagowanie na TGF- .. W przypadku mieloidalnych testów progenitorowych badających reakcję na TGF-. ligand, oczyszczamy Lin. komórki z komórek szpiku kostnego przy użyciu zestawu do izolacji magnetycznej Lineage Cell Depletion i separatora AutoMACS zgodnie z instrukcjami producenta (Miltenyi Biotec). ST-HSC / MPP (LSK CD34 +) zostały posortowane z tych komórek. Następnie 5 x 102 komórek ST-HSC / MPP wysiano w 1,1 ml pozbawionej surowicy metylocelulozy (M3134, StemCell Technologies) uzupełnionej 15% FBS (Lonza), x BIT (StemCell Technologies), 100. M MTG (Sigma-Aldrich). ), 2 mM glutaminy (Invitrogen), 50 ng / ml rekombinowanego mysiego SCF (rmSCF) (R & D Systems), 10 ng / ml rmIL-3 (R & D Systems), 10 ng / ml rmIL-6 (R & D Systems), aw obecność lub brak rekombinowanego ludzkiego TGF-pi (10 ng / ml) (R & D Systems) i / lub 10. M TGF-. inhibitor (SB431542; Sigma-Aldrich). Komórki umieszczono na płytkach hodowlanych o średnicy 35 mm i inkubowano w wilgotnej atmosferze z 95% powietrza i 5% CO2 w 37 ° C. Kolonie mieloidalne oceniano w 8. dniu za pomocą mikroskopii świetlnej. Aby zablokować TGF-. in vivo myszy traktowano buforem neutralizującym 2G7. TGF-a; IgG2 (R & D Systems) dostarczył ip w dawce 15 mg / kg raz w tygodniu przez 5 tygodni. Myszy następnie uśmiercano. Histopatologia i analizy immunohistochemiczne. Przekrój szpiku kostnego, śledziony i wątroby ustalono na co najmniej 72 godziny w 10% obojętnej buforowanej formalinie, odwodniono w alkoholu, oczyszczono w ksylenie i infiltrowano parafiną na zautomatyzowanym procesorze (Leica TP1020). Skrawki tkanki (o grubości 4 urn) umieszczono na naładowanych szkiełkach, odparafinowano w ksylenie, oczyszczono za pomocą stopniowanych roztworów alkoholowych, ponownie uwodniono w wodzie i wybarwiono H & E. Immunohistochemię przeprowadzono na skrawkach tkanki zatopionych w parafinie z użyciem pierwotnych przeciwciał skierowanych przeciwko Mac1 (BD Biosciences. Pharmingen) lub Ki67 (Abcam). Cytometria przepływowa i analiza sortowania komórek. Analizę FACS przeprowadzono na komórkach krwi, komórkach szpiku kostnego lub splenocytach od myszy. Pokrótce, w razie potrzeby przygotowano zawiesinę pojedynczych komórek i barwiono je przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi. Komórki przemyto dwukrotnie x PBS i ponownie zawieszono w x PBS / 30% FBS. Lin. komórki zidentyfikowano przez brak sygnału po barwieniu koktajlem z biotynylowanym przeciwciałem zawierającym B220, CD3, Terll9, Mac1 i Grl (BD Biosciences P Pharmingen) i wywoływanie przez streptawidynę. Alexa Fluor 405 (Invitrogen). Przeciwciała Grl-FITC, Mac1AA Alexa Fluor 647, Terll9aAlaa Fluor 405, CD71-PE, Sca1-PE, c-Kit APCH7, CD150-APC, CD48-FITC, CD34-FITC i CD16 / 32-PECya7 zostały dodano i inkubowano na lodzie. Analizę sortowania komórek przeprowadzono na Lin. komórki oczyszczone z komórek szpiku kostnego przy użyciu zestawu do izolacji magnetycznej Lineage Cell Depletion i separatora AutoMACS zgodnie z instrukcjami producenta (Miltenyi Biotec). Cytometria przepływowa została przeprowadzona na LSRII (BD) i sortowaniu komórek na FACSAria (BD) przy użyciu oprogramowania DIVA (BD) i zastosowano automatyczne kompensacje. Wyniki analizowano za pomocą oprogramowania FlowJo (Tree Star Inc.). W celu analizy i sortowania komórek progenitorowych HSC i hematopoetycznych, próbki kompensacji barwy wytworzono przez pojedyncze zabarwienie komórek szpiku kostnego lub Lin. komórki z jednym przeciwciałem każdego fluorochromu lub z kombinacją komórek barwionych metodą Fluorescence Minus One (FMO), które przeprowadzono przez sekwencyjne dodanie przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie do koktajlu barwiącego. Q-PCR w czasie rzeczywistym u myszy. Całkowity RNA wyizolowano z komórek szpiku kostnego i splenocytów przy użyciu odczynnika TRIzol (Invitrogen) zgodnie z instrukcjami producenta
[przypisy: jak radzić sobie ze stresem w szkole, psychoterapia na czym polega, maseczka z siemienia lnianego na włosy ]
[patrz też: crt p, kalendarzyk miesiączkowy ob, przeciwwskazania do mikrodermabrazji ]