Skip to content

Tlx działa jako przełącznik proangiogenny, regulując pozakomórkowy skład matryc fibronektyny w astrocytach siatkówki ad 8

2 miesiące ago

690 words

Po wykryciu niedotlenienia poziomy transkrypcji VEGF i Tlx są regulowane w górę, z jednoczesną regulacją w górę transkrypcji fibronektyny w tych astrocytach. Tlx kontroluje następnie kaskady wtórne molekularne wymagane do zestawiania matryc fibronektyny i regulacji zachowania astrocytów poprzez represję ekspresji GFAP. Po związaniu z naczyniami krwionośnymi natlenianie zmniejsza liczbę genów indukowalnych przez hipoksję w astrocytach, wyłączając tym samym działania proangiogenne. Następnie, astrocyty w ich stanie nieangiogennym nadal współpracują z komórkami śródbłonka poprzez inne cząsteczki sygnałowe i kontakty komórka-komórka w celu utrzymania homeostazy naczyniowej, w szczególności przez promowanie tworzenia i utrzymywania bariery krew-siatkówka. Rysunek 7 Model dla sieci molekularnych regulujących przełączniki proangiogenne w astrocytach siatkówki. Po wykryciu niedotlenienia, aktywowane HIF zwiększają przede wszystkim poziomy transkrypcyjne VEGF i prawdopodobnie Tlx. Tlx następnie kontroluje kaskady wtórne zaangażowane w pozakomórkowy zespół rusztowań fibronektyny, z towarzyszącą represją GFAP. Po związaniu z naczyniami krwionośnymi, geny indukowane niedotlenieniem, które wspierają stan proangiogenny, są zmniejszane przez zwiększenie stężenia tlenu. Wreszcie, astrocyty siatkówki zwiększają poziom GFAP i tworzą barierę krew-siatkówka we współpracy z komórkami śródbłonka. Metody Myszy. Myszy ICR zakupiono od SLC Japan, a myszy transgeniczne GFAP-GFP i Tie2-GFP zakupiono w Jackson Laboratory. Myszy Heterozygous Tlx KO (26) krzyżowano w celu uzyskania szczeniąt, które genotypowano za pomocą PCR. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Badań nad Zwierzętami w Ośrodku Biologii Rozwoju RIKEN i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi RIKEN dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach i zrekombinowanych DNA. Histologia, immunobarwienie i ISH. W przypadku preparatów na całym wierzchu izolowano miseczki siatkówki i utrwalano w 4% roztworze paraformaldehydu / PBS przez noc. Procedury immunohistochemiczne na całej długości zostały wykonane zgodnie z wcześniejszym opisem (51). W przypadku całego ISH, siatkówki krótko trawiono proteinazą K i hybrydyzowano z sondami RNA znakowanymi digoksygeniną. Po hybrydyzacji próbki inkubowano ze skoniugowanymi z fosfatazą alkaliczną przeciwciałami antydigoksygeninowymi (Roche Diagnostics Corp.), a sygnały wizualizowano za pomocą nitrobetalowego fosforanu tetrazoliowego / 5-bromo-4-chloro-3-indoilowego (Roche Diagnostics Corp.). W połączeniu ISH i immunohistochemii znakowanie przeciwciał przeprowadzono po zakończeniu protokołu ISH. Szablony dla sond (VEGF, 825. 1172 z NM_009505: fibronektyna, 2466. 2831 z BC_025521: Tlx, 683. 1840 z NM_152229) otrzymano przez odwrotną transkrypcję całkowitego RNA z 4-dniowych siatkówek myszy ICR i amplifikacji PCR. Szablon sondy GFAP RNA był prezentem od Jamesa Cohena (King. S College London, Londyn, Wielka Brytania). W przypadku kriosekcji oczy zamrożono w związku OCT (Sakura Finetek i przekrojono na grubość 10 .m. Barwienie jądrowe przeprowadzono stosując jodek TO-PRO-3 (Invitrogen Corp.) Abs Primary Abs do immunohistochemii były monoklonalne anty-GFAP (klonowane GA-5, sprzężone z Cy3, Sigma-Aldrich), PECAM-1 (klon Mec13.3; BD Biosciences. Pharmingen), integryna A5 (klon 5H10-27; BD Biosciences. Pharmingen), integryna. (klon 9EG7; BD Biosciences. Pharmingen), poliklonalne anty-PDGFRa (systemy R & D), fibronektyny (DakoCytomation), kolagenu typu IV (Cosmo Bio Co.) i GFP (Invitrogen Corp.). Drugorzędowymi przeciwciałami były kózka sprzężona z fluorescencją Alexa 488 lub osiołkowe IgGs (Invitrogen Corp.) i sprzężone z Cy3- lub Cy5 IgG osła (Jackson ImmunoResearch Laboratories) Biotynylowana izolektyna B4 (Bandeiraea simplicifolia) i skoniugowane z Cy3 przeciwciało monoklonalne antybiotyna zakupiono od Sigma-Aldrich Mikroskopia Zdjęcia do multilabelkowej immunohistochemii zostały zrobione za pomocą laserów skanujących Zeissa radzić sobie z oprogramowaniem do obrazowania konfokalnego LSM510 (wersja 3.2; Zeiss). Zdjęcia do ISH sfotografowano mikroskopem Axioplan2 (Zeiss) wyposażonym w kamerę CCD (AxioCam HRc; Zeiss) i powiązanego oprogramowania (AxioVision, wersja 3.1, Zeiss). W połączonej immunohistochemii ISH zdjęcia z tych samych pól były oddzielnie pobierane w czerni i bieli, następnie sygnały były kolorowane i łączone z oprogramowaniem Adobe Photoshop 6.0. Zastrzyki śródoczne. Jedną mg / ml monoklonalnego chomika przeciwciała przeciwko mysiemu integrynie a (klon HM. 1-1, BD Biosciences . Pharmingen) lub VEGF TrapR1R2 (Regeneron Pharmaceuticals) w jałowym buforze wstrzyknięto do ciała szklistego stosując szklane kapilarne pipety z mikromanipulatorem (Drummond Scientific Co.)
[przypisy: wrzodziejące zapalenie jelita grubego objawy, przeciwwskazania do mikrodermabrazji, jak radzić sobie ze stresem w szkole ]
[przypisy: badania elektrofizjologiczne, crt p, kalendarzyk miesiączkowy ob ]