Skip to content

Stosowanie 3 ligandów TLR jako łączonego adiuwanta indukuje jakościowe zmiany w odpowiedziach komórek T potrzebne do ochrony antywirusowej u myszy ad 8

2 miesiące ago

719 words

Czynniki immunologiczne oprócz IL-15 i ich możliwy wpływ na różnicowanie komórek T również zasługują na dalsze badania. Metody Zwierzęta i komórki. Samice myszy BALB / c (6. 8 tygodni) zakupiono w Frederick Cancer Research Center (Frederick, Maryland, USA) lub Taconic i trzymano w warunkach wolnych od patogenów w Instytucie Zwierząt Raka w National Cancer Institute. TIRAP. /. i Ifnar1. /. myszy zostały wygenerowane przez Shizuo Akira (37) i Daniela Portnoya (56), odpowiednio. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Pielęgnacji i Używania Zwierząt w National Cancer Institute. Linie komórkowe CV-1 uzyskano z ATCC. Wyizolowane komórki myszy hodowano w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% dezaktywowaną termicznie FCS, 2 mM l-glutaminą, 100 U / ml penicyliny i 100 ug / ml streptomycyny. Komórki BM hodowano w 7 x 105 / ml przez 6 dni w obecności GM-CSF (Peprotech) w stężeniu 15 ng / ml. DC otrzymano z komórek w zawiesinie (5). Gdy komórki te były hodowane wspólnie z oczyszczonymi limfocytami T, stosunek wynosił 1: 2,5 (komórki DC / T). Szczepionki, odczynniki i immunizacja. PCLUS3-18IIIB (KQIINMWQEVGKAMYAPPISGQIRRIQRGPGRAFVTIGK), P18-I10 (RGPGRAFVTI) i OVA257-264 (SIINFEKL) zostały zsyntetyzowane przez NeoMPS. Ligandy TLR obejmujące MALP2 i poli (I: C) zakupiono od Invitrogen. Równoustrojowe mieszaniny fosforo-tionowych CpG ODN 1555 i 1466 zastosowano w sposób opisany uprzednio (5). W doświadczeniach in vitro, dawkowano MALP2, poli (I: C) i CpG ODN w stężeniu odpowiednio 0,1 .g / ml, 25 .g / ml i 2 .g / ml. W przypadku immunizacji sc, te ligandy zmieszano w ilości 0,1 .g, 25 .g i 2 .g na dawkę. W przypadku immunizacji icr ich dawki wynosiły 0,2 | ig, 50 | ig i 4 | ig na wstrzyknięcie. 20 .g lub 100 .g PCLUS3-18IIIB zastosowano odpowiednio do immunizacji sc lub icr. W celu immunizacji DC, 2 x 105 DC stymulowano ligandami TLR in vitro przez 20 godzin i pulsowano peptydem (5 .M P18-I10) przez 2 godziny. Co najmniej 3 zwierzęta lub próbki zostały włączone do każdej grupy i dla każdego punktu czasowego. immunizację metodą icr przeprowadzono jak opisano wcześniej z modyfikacjami (29). Pokrótce, ligandy peptydowe i TLR zmieszano z 20 .g odczynnika do liposomalnego transfekcji DOTAP (Roche Diagnostic Corp.) i dostarczono w dniach 0, i 2 z wypolerowaną końcówką pipety przez kanał odbytu. Trzy tygodnie później myszy były stymulowane tymi samymi szczepionkami przez 3 dni z rzędu. Rekombinowany wirus replikacyjny vPE16 w dawce 2 x 107 PFU zastosowano do prowokacji icr (29, 57). Izolacja i oczyszczanie komórek. Poplitealne komórki LN izolowano po immunizacji stópką. W celu oczyszczenia komórek T pobierano śledziony od myszy naiwnych. Całkowite komórki T oddzielono przez rozdzielenie negatywne (w celu uniknięcia zaburzeń) na Separator autoMACS (Miltenyi Biotec), stosując koktajl przeciwciał przeciwko CD45R, CD49b, CD11b i Ter-119. Czystość posortowanych populacji komórek wynosiła co najmniej 97%. Cytometria przepływowa i pomiary cytokin. Przeciwciała do cytometrii przepływowej zakupiono z eBioscience lub BD Biosciences. Do pomiaru wewnątrzkomórkowego IFN-y w limfocytach T komórki stymulowano przez 5 godzin w 37 ° C peptydem P18-I10 w różnych stężeniach (101. 10. 8. M z 10-krotnym seryjnym rozcieńczeniem) w obecności 1. g / ml brefeldyny A Przeciwciała monoklonalne anty-CD107a zostały dodane razem z peptydem po ponownej stymulacji. W celu zmierzenia wewnątrzkomórkowej cytokiny w hodowanych w warunkach in vitro DC, komórki stymulowano ligandami TLR przez 20 godzin przed barwieniem. Komórki LN wyizolowane 48 godzin po immunizacji peptydem badano ex vivo pod względem wewnątrzkomórkowych cytokin. Po barwieniu powierzchni komórki utrwalono i permeabilizowano, a następnie inkubowano z przeciwciałami przeciwko cytokinom. Przykładowe dane uzyskano za pomocą FACSCalibur lub LSR II (BD) i analizowano za pomocą oprogramowania FlowJo (TreeStar Inc.). W celu określenia wydzielanych cytokin i chemokin z DC, supernatanty z hodowli zebrano i zmierzono za pomocą zestawów LINCOplex (Linco Research Inc.) w systemie Bio-Plex, stosując technologię Luminex xMAP zgodnie z instrukcjami producenta. Supernatanty inkubowano z przeciwciałami wychwytującymi przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Test CTL in vivo i ex vivo. Test CTL in vivo przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (58) z modyfikacją. W skrócie, splenocyty od naiwnych myszy pulsowano peptydem przy różnych stężeniach molowych (10. 2 lub 10. 4) lub bez peptydu. Każdą z populacji komórek znakowano następnie odpowiednio 5 (M, 0,5. M lub 0,05. M CFSE (Invitrogen). 5 x 106 komórek od każdego celu zmieszano w 200 ul PBS na biorcę i przeniesiono przez iv
[przypisy: nadpobudliwość psychoruchowa u dzieci, leki na wątrobę bez recepty, crt kardiologia ]
[hasła pokrewne: ciasta bezglutenowe przepisy, peeling kawitacyjny przeciwwskazania, leki na wątrobę bez recepty ]