Skip to content

Rola różnych szlaków kaskady dopełniacza w eksperymentalnym pemfigoidzie pęcherzykowym ad 8

1 miesiąc ago

738 words

Aby utrzymać myszy neonatalne przy życiu przez dłużej niż 3 dni, noworodki myszy powracały do swoich klatek natychmiast po wstrzyknięciu. Zakres choroby skórnej oceniono w następujący sposób: 0, brak wykrywalnej choroby skóry; 1, łagodna rumieniowa reakcja bez oznak naskórkowego oznakowania odrywania (wywołana delikatnym tarciem skóry myszy, gdy dodatnia, to wytworzyło drobne, trwałe marszczenie się naskórka); 2, intensywny rumień i naskórkowy znak dystrofii obejmujący 10%. 50% naskórka na obszarach zlokalizowanych; 3, intensywny rumień ze szczerym naskórkowym oznakowaniem dystalnym, obejmującym ponad 50% naskórka w miejscu wstrzyknięcia. Po badaniu klinicznym zwierzęta uśmiercono i otrzymano próbki skóry i surowicy. Każdą część skóry (o wymiarach około 6 × 6 mm) pocięto na 3 części z linii centralnych: jedną (około 3 x 3 mm) do rutynowego badania histologicznego za pomocą mikroskopii świetlnej (barwienie H & E), aby zlokalizować miejsce uszkodzenia i infiltrację PMN i barwienie błękitem toluidynowym w celu ilościowego oznaczenia degranulacji MC i MC, jeden (w przybliżeniu 3 x 3 mm) do bezpośrednich testów IF w celu wykrycia króliczego IgG i odkładania myszy C3 w BMZ i jeden (w przybliżeniu 3 x 6 mm) w teście enzymatycznym MPO w celu ilościowego określenia Kumulacja PMN w miejscu wstrzyknięcia skóry, jak opisano poniżej. Surowice wstrzykniętych zwierząt badano za pomocą pośrednich technik IF w celu określenia miana króliczych przeciwciał anty-mBP180 z użyciem kriosekcji skóry myszy jako substratu. Bezpośrednie i pośrednie badania IF przeprowadzono jak opisano uprzednio (36) przy użyciu dostępnego w handlu sprzężonego z FITC koziego anty-króliczego IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.). Monospecyficzne kozie anty-mC3 IgG zakupiono od Cappel Laboratories. Hamowanie C1q in vitro i in vivo. W celu hamowania in vitro C1q skrawki skóry myszy noworodków inkubowano z oczyszczoną króliczą anty-mBP180 lub kontrolną IgG przez godzinę, po czym świeżo przygotowaną surowicę mysią dodano jako kompletne źródło dopełniacza w obecności oczyszczonego szczurzego przeciwciała monoklonalnego anty-mC1q lub kontrola izotypowa szczurzego IgG1. Po godzinie inkubacji odkładanie in situ mysiego C1q i mysiego C3 w BMZ wykryto, odpowiednio, skoniugowanym z FITC szczurzym przeciwciałem monoklonalnym anty-mC1q i skoniugowanym z FITC monoswoistym kozim przeciwciałem anty-MCC3. W celu hamowania C1q in vivo noworodkom myszy C57BL / 6J wstrzyknięto id 5 .g oczyszczonego szczurzego przeciwciała monoklonalnego anty-mC1q lub kontrolnego szczurzego IgG1a. Dwie godziny później myszom wstrzyknięto idiotyczną anty-mBP180 IgG (2,64 mg / g masy ciała), a następnie badano 12, 24 i 48 godzin po patogennym wstrzyknięciu IgG, jak opisano powyżej. Oczyszczone szczurze przeciwciało monoklonalne anty-mC1q i szczurzy IgGlp. Kontrola izotypowa została zakupiona od Cedarlane Laboratories Ltd. Kwantyfikacja MC i degranulacja MC. Skrawki skóry (w przybliżeniu 3 x 3 mm) myszy, którym wstrzyknięto IgG, utrwalono w 10% formalinie. Skrawki parafiny (o grubości 6 um) przygotowano i wybarwiono błękitem toluidyny i H & E. Skórne MC zostały policzone przez 2 osoby w laboratorium w sposób zaślepiony i sklasyfikowane jako zdekranulowane (> 10% granulek wykazujących fuzję lub wyładowanie) lub normalne w 5 losowych polach pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu × 400 (38,51). Nie było znaczącej różnicy między dwoma indywidualnymi odliczeniami (dla całkowitych MC, 32,20 . 6,52 wobec 36,97. 11,55, P = 0,082). MC z całkowitą degranulacją, którą można było pominąć przez barwienie błękitem toluidynowym, identyfikowano przez pośredni IF z skoniugowanym z FITC szczurzym przeciwciałem monoklonalnym przeciw-mysim c-kit (BD Biosciences). Wyniki wyrażono jako procent zdegranulowanego MC (liczba degranulujących MC na całkowitą liczbę MC w 5 losowych polach × 100%). Kwantyfikacja akumulacji PMN w miejscach wstrzyknięcia przeciwciał. Aktywność MPO w tkankach była stosowana jako wskaźnik PMN w próbkach skóry zwierząt doświadczalnych, jak opisano w innym miejscu (52). Wcześniej wykazaliśmy, że kliniczne pęcherze skórne są bezpośrednio skorelowane z liczbą infiltracyjnych PMN w miejscu wstrzyknięcia IgG (39). Próbki skóry myszy (w przybliżeniu 3 x 6 mm) ekstrahowano przez homogenizację w 500 .l buforu do ekstrakcji. Zawartość MPO wyrażono jako względną aktywność MPO (OD460 / mg białka). In vivo stymulacja degranulacji MC. Aby stymulować degranulację MC, noworodkowe C4. /. myszom wstrzyknięto związek 48/80 (1 .g / g masy ciała; Sigma-Aldrich), środek do degranulowania MC. Degranulację skóry MC zanalizowano przez barwienie błękitem toluidynowym, a infiltrację skóry PMN oznaczono ilościowo za pomocą testu MPO. Izolacja i identyfikator
[patrz też: ciekawe miejsca w czechach, crt p, leki na wątrobę bez recepty ]
[patrz też: crt kardiologia, badanie elektrofizjologiczne serca, kardiolog blog ]