Skip to content

Przedoperacyjny test diagnostyczny odróżniający łagodny od złośliwego raka tarczycy na podstawie ekspresji genów ad 8

1 miesiąc ago

688 words

Jeden mikrogram całkowitego RNA potraktowano wolnym od DNA (Ambion Inc., Austin, Texas, USA) i poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA przy użyciu zestawu do odwrotnej transkryptazy Omniscript (QIAGEN Inc., Germantown, Maryland, USA) z oligo-dT12. -18 starter i 10 U inhibitora RNazy (Invitrogen Corp.). Próbki ujemne odwrotnej transkryptazy przygotowano dla każdej indywidualnej reakcji i zastosowano jako kontrole do wykrywania zanieczyszczenia testowego. Następnie cDNA rozcieńczono pięciokrotnie, a porcje o objętości 1,5-1 .l zastosowano w reakcjach PCR o masie cząsteczkowej 20 .l, zawierających 10 .M każdego specyficznego startera, x iQ Supermix (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, California, USA), i SYBR Green (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). Reakcję PCR prowadzono przez 40 cykli czteroetapowego programu: 94 ° C przez 30 sekund, temperatura hybrydyzacji przez 15 sekund, 72 ° C przez 15 sekund i etap odczytu fluorescencji przez 10 sekund. Po PCR przeprowadzono analizę krzywej topnienia i temperaturę odczytu dla każdego testu ustawiono powyżej temperatury topnienia krótkich dimerów starterów i poniżej temperatury docelowego produktu PCR. Ilościowe reakcje PCR przeprowadzono dwukrotnie w trzech powtórzeniach; cykle progowe (Ct) otrzymano stosując oprogramowanie iCycler wersja 3.0 (Bio-Rad Laboratories Inc.) i uśredniono (SD. 1). Ekspresję genu znormalizowano do średniej dwóch genów kontrolnych, białka rybosomalnego S8 i kompleksu t 1, wykazanego przez SAGE jako równoważnych poziomów we wszystkich trzech bibliotekach SAGE. Względną ekspresję obliczono zgodnie ze wzorem 2 (Rt. Et) / 2 (Rn. En), gdzie Rt jest liczbą Ct obserwowaną w próbce doświadczalnej dla dwóch genów kontrolnych, Et jest liczbą Ct obserwowaną w próbce doświadczalnej dla gen referencyjny, Rn jest średnią liczbą Ct obserwowaną w dziesięciu gruczolach dla dwóch genów kontrolnych, a En jest średnią liczbą Ct obserwowaną w dziesięciu gruczolakach dla genu referencyjnego (53). Wyniki uzyskane z 14 z 17 poziomów względnego ekspresji w 23 próbkach i prawidłowej tkance, przedstawione na Figurze 1, zastosowano do analizy statystycznej. Użyto tylko 14, ponieważ trzy geny nie wykazały żadnej różnicy w reakcji PCR. Startery specyficzne dla PCR, temperatury hybrydyzacji i temperatury odczytu fluorescencji zestawiono w Tabeli dodatkowej 1. Produkty PCR rozdzielono przez elektroforezę w 3% żelu agarozowym / etidowym. Analiza immunohistochemiczna. Barwienie immunohistochemiczne przeprowadzono na skrawkach tkankowych zatopionych w parafinie (3 .m) umieszczonych na 0,1% pokrytych polilizyną płytkach (Sigma-Aldrich), odparafinowanych z ksylenem i ponownie uwodnionych za pomocą szeregu stopniowanych alkoholi. Endogenna aktywność fosfatazy alkalicznej została zablokowana przez 3% nadtlenek wodoru. Po odzyskaniu ciśnienia gotowania (10 mmol / l buforu cytrynianowego, pH 7,4, przez 2 minuty), sekcje blokowano w x PBS / 0,1% BSA przez godzinę w temperaturze pokojowej i inkubowano z pierwszym przeciwciałem przez co najmniej 16 godzin. w 4 ° C. Znakowany kompleks streptawidyny i odczynników biotyny (zestaw DAKO LSAB + HRP i DAKO Corp., Carpinteria, California, USA) zastosowano jako substrat dla tetrahydrochlorku 3,3-diaminobenzydyny (DAB) (Sigma-Aldrich). Jako kontrast jądrowy użyto hematoksyliny. Slajdy zostały zamontowane w medium montażowym Faramount (DAKO Corp.) i zbadane pod mikroskopem świetlnym. Immunopozytywność była oceniana przez dwóch niezależnych obserwatorów w sposób półilościowy, w którym względną obfitość każdego antygenu oceniano przez zliczenie 1000 komórek w co najmniej pięciu losowo wybranych polach fragmentów tkanki przy powiększeniu x 400 i oceniano w następujący sposób:., Ujemny ; +, słaby; ++, umiarkowanie obfite; +++, silny. Poliklonalna surowica odpornościowa GADD153, pochodząca z mapowania peptydów na C-końcu DDIT3 pochodzenia ludzkiego, została użyta w rozcieńczeniu 1: 200 (R-20; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Kalifornia, USA). Poliklonalną surowicę odpornościową arginazę II, wytworzoną przeciwko rekombinowanemu białku na aminokwasy 291. 354 mapujące na C-końcu ludzkiej arginazowej II typu, użyto w rozcieńczeniu 1: 100 (H-64; Santa Cruz Biotechnology Inc.). Zastosowano monoklonalny czynnik von Willebranda VIII w rozcieńczeniu 1:25 (M0616; DAKO Corp.). Przeciwciało monoklonalne CA9 (dar E. Oosterwijk, University Medical Center, Nijmegen, Holandia) zastosowano w rozcieńczeniu 1: 400. Kontrola specyficzności przeciwciała obejmowała inkubację ze szczurzym IgG, stosowaną w tym samym stężeniu co pierwsze przeciwciało (Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, USA). W każdym przebiegu uwzględniono kontrolę pozytywną i negatywną. Analiza statystyczna. Aby zidentyfikować geny, dla których poziomy ekspresji różniły się istotnie pomiędzy FTA i FTC, wykorzystaliśmy dane dotyczące względnej ekspresji uzyskane z analizy RT-PCR na 14 z 17 genów (Tabela uzupełniająca 1)
[hasła pokrewne: badania elektrofizjologiczne, crt kardiologia, kardiolog blog ]
[patrz też: kardiolog blog, badania elektrofizjologiczne, crt p ]