Skip to content

Neurony dopaminergiczne wytwarzane z funkcji embrionalnych komórek macierzystych małpy w modelu naczelnych Parkinsona ad

2 miesiące ago

592 words

W tym momencie punkt 78,3%. 7,5% wszystkich komórek było immunoreaktywnych dla NCAM, 75,0%. 15,4% dla Musashi-1 i 72,3%. 9,1% dla innego neuronowego markera progenitorowego, Nestin (14). Wyniki te wskazują, że większość komórek ES została przypisana do linii nerwowej do dnia 14 hodowli na warstwach odżywczych. Ryc. 1. Naturalne komórki progenitorowe indukowane z komórek ES naczelnych. (A) Przebieg czasowy ekspresji markera progenitorowego neuronu w małpich komórkach ES hodowanych na komórkach PA6. (B) Oddzielne kolonie komórek ES tworzyły sfery podobne do komórek neuronowych progenitorowych. (C. E) Kule były immunoreaktywne dla NCAM (C, zielony), Musashi-1 (D, czerwony) i Nestin (E, zielony). Pasek skali: 100 .m. Charakterystyka in vitro neuronalnych komórek progenitorowych pochodzących z małpich komórek ES. W celu dalszego wzbogacenia komórek progenitorowych komórek nerwowych, odłączyliśmy komórki ES od warstwy odżywczej w dniu 14, a następnie kontynuowano hodowlę komórek na niepowlekanych szalkach w pożywce bez surowicy zawierającej FGF2, EGF i czynnik hamujący białaczkę (LIF). W ciągu kilku następnych dni komórki utworzyły sfery morfologicznie przypominające te utworzone przez neuronowe komórki progenitorowe (Figura 1B). Te sfery były dodatnio wybarwione przeciwciałami swoistymi dla markerów komórek nerwowych progenitorowych NCAM, Musashi-1 i Nestin (Figura 1, C = E). Aby określić potencjał tych komórek do różnicowania, komórki ekspandowaliśmy jako kulki przez 7 dni, następnie indukowaliśmy różnicowanie przez hodowanie komórek na szkiełkach powlekanych poli-l-ornityną i lamininą (powleczonych OL) przez 7 dni. Usunęliśmy mitogeny FGF2, EGF i LIF z pożywki, zamiast dodawać czynniki neurotroficzne, takie jak czynnik neurotropowy pochodzenia mózgowego i neurotrofina-3. Analiza metodą immunofluorescencji wykazała, że komórki różnicowały się w dojrzałe komórki nerwowe eksprymujące markery neuronalne TuJ1 (52,8%. 16,0% DAPI) i Map2ab (38,3%. 7,5% DAPI), kwaśne białko włókniste markera astroglejowego (GFAP) (28,6%). > 17,6% DAPI) i markerem oligodendralnym C-galaktocerebrozyd C (GalC) (0,6%> 0,4% DAPI) (Figura 2, A (D i I). Dalsze analizy wykazały, że te neurony pochodzące z komórek ES były immunoreaktywne dla kwasu a-aminomasłowego (GABA) (28,6%. 10,7% TuJ1), glutaminianu (14,3%. 5,3% TuJ1), acetylotransferazy choliny (ChAT) (0,7%). 0,3% TuJ1) i serotoninę (3,3% -1,7% TuJ1) (Figura 2, E (H i J). Te wyniki sugerują, że kule pochodzące z komórek ES zawierają neuronowe komórki progenitorowe. Figura 2 Ekspresja zróżnicowanych neuronowych i neuronalnych markerów podtypu. Zróżnicowane sfery wybarwiono przeciwciałami przeciwko TuJ1 (A i B, zielony, E (H, niebieski), GFAP (B, czerwony), Map2ab (C i D, zielony), GalC (D, czerwony), GABA (E, czerwony ), glutaminian (Glu; F, zielony), serotoninę (Ser, G, czerwony) i ChAT (H, zielony). Pasek skali: 100 .m. Proporcje komórek wyrażających zróżnicowane markery nerwowe (I) i związane z neuroprzekaźnikami (J) wyrażono jako średnią. SD 3 niezależnych kultur. Wpływ czynników wzrostu na różnicowanie neuronów DA. Skuteczne leczenie PD wymaga znacznych ilości neuronów DA. Odsetek komórek pozytywnych pod względem hydroksylazy tyrozynowej (TH-pozytywnych) pochodzących z neurosfer było tylko 5,4%. 1,8% komórek TuJ1-dodatnich (rysunek 2J). Aby zwiększyć odsetek tych komórek, zbadaliśmy wpływ różnych kombinacji czynników wzrostu na kulturę neurosfery. Odsetek neuronów TH-pozytywnych z całości komórek Tuj1-dodatnich wzrósł do 24% w obecności FGF2 i FGF20 (Figura 3, AEE). Ani FGF2, ani sam FGF20 nie powodowały wzrostu liczby neuronów TH-dodatnich. Jednak w obecności FGF2, FGF20 zwiększał szybkość różnicowania TH w sposób zależny od dawki (1 pg / ml = 3,8%. 1,8% TuJ1, 10 pg / ml = 8,8%. 4,8% TuJ1, ng / ml = 24,3%. 9,8% TuJ1). Figura 3DA neurony różniące się od neurosfer pochodzących z komórek ES. (A (D) Zróżnicowane sfery traktowane FGF2 i FGF20 barwiono przeciwciałami przeciw TH (czerwony) i TuJ1 (zielony). Skalowane pręty: 50 .m. (E) Udział komórek z dodatnim TH w komórkach TuJ1-dodatnich jest wyrażony jako średnia. SD od 3 do 5 niezależnych kultur. * P <0,05. (F) RT-PCR dla śródmózgowych markerów neuronu DA Pax2, Ptx3, Nurr1, Lmx1b i TH w komórkach traktowanych FGF2 i FGF20 (po lewej) lub FGF2 i EGF (po prawej). (G) Pomiar stężenia dopaminy w HPLC, uwalniany przez małpich komórek ES leczonych SDIA- i FGF2 i FGF20 w odpowiedzi na wysokie bodźce depolaryzujące K + (niebieska linia). Standard dopaminy, czerwona linia. Analizy RT-PCR wykazały, że komórki pochodzące z neurosfer indukowanych przez SDIA eksprymowały śródmózgowe markery neuronów DA, takie jak Pax2, Ptx3, Nurr1, Lmx1b i TH (15, 16) [patrz też: crt p, nakładanie żelu na paznokcie, badanie elektrofizjologiczne serca ] [podobne: leki na wątrobę bez recepty, wiarygodny test internetu, jak radzić sobie ze stresem w szkole ]