Skip to content

Neurony dopaminergiczne wytwarzane z funkcji embrionalnych komórek macierzystych małpy w modelu naczelnych Parkinsona ad 8

1 miesiąc ago

701 words

Małpy objęto opieką i postępowano zgodnie z Wytycznymi dla eksperymentów na zwierzętach z Uniwersytetu w Kioto i Krajowym Centrum Chorób Serca (Osaka, Japonia) oraz z Przewodnikiem po opiece nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystywaniem w Instytucie Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych (ILAR, Washington, DC, USA). USA). MRI. Aby uzyskać dokładną orientację skorupy, zwierzęta (n = 10; 6 dla przeszczepionego ES i 4 dla grupy pozorowanej) zostały poddane badaniu MRI przy użyciu systemu 3.0 Tesla Signa (General Electric). Po znieczuleniu przez wstrzyknięcie domięśniowe chlorowodorkiem ketaminy (15 mg / kg, Sankyo Co.) i ksylazyną (1,5 mg / kg, Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc.) zwierzęta umieszczono w magnesie za pomocą zgodnej z MR głowicy. Obrazy ważone T1 zostały wykorzystane do dalszego badania. Przeszczep. Po znieczuleniu pentobarbitalem (7,5 mg / kg, domięśniowo [0] Dainippon Pharmaceutical Co.) i ketaminą (10 mg / kg, im), małpy unieruchomiono w ramie chirurgicznej (Narishige SN-1N, Narishige Co.). Do każdego zwierzęcia zebrano komórki progenitorowe neuronowe z hodowli komórek ES w dwóch szalkach o średnicy 6 cm (300 000. 600 000 komórek na szalkę). Podczas gdy komórki ES rozszerzały się w postaci kulek, do pożywki hodowlanej dodano BrdU (5 ug / ml; Sigma-Aldrich) przez 7 dni w celu znakowania komórek ES. Za pomocą wstrzykiwacza elektrycznego (Muromachi Kikai Co.) przeszczepiliśmy komórki dawcy do skorupy, stosując wyniki MRI dla każdej małpy i atlasu mózgu M. fascicularis (36, 50). Aby zakryć skorupę od środka do tylnej, ustalono 3 cele odległe o 2 mm w położeniu przednio-tylnym i 1. 2 mm w położeniu środkowo-bocznym i wykonano 4 iniekcje (1. L / 60 sekund dla każdego wstrzyknięcia) wzdłuż każdy trakt. Po operacji wszystkie zwierzęta otrzymywały antybiotyki przez tydzień i codzienny środek immunosupresyjny (cyklosporyna A, 10 mg / kg, im, Carbiochem) aż do uśmiercenia. Miesięczne analizy krwi przeprowadzone w trakcie eksperymentu potwierdziły poziomy krążącej cyklosporyny A, która wynosiła średnio 393 ng / ml. U kontrolnych małp poddawanych operacjom pozorowanym równoważną objętość pożywki hodowlanej podawano bez komórek. Następnie wstrzykiwano antybiotyki i leki immunosupresyjne, tak jak w przypadku małp z przeszczepionymi komórkami. Badanie immunofluorescencji. W badaniach in vitro komórki utrwalano w 4% paraformaldehydzie przez 10 minut w celu obserwacji mikroskopowej. W badaniach in vivo, po podaniu głębokiego znieczulenia pentobarbitalem i ketaminą, małpy (n = 10; 6 dla przeszczepionych komórek ES i 4 dla pozornie operowanych grup) poddano przezsercowej perfuzji 4% paraformaldehydem. Wycięte mózgi zamrożono i pocięto mikrotomem o grubości 50 .m. Skrawki następnie zabarwiono metodą swobodnego płynięcia. Skrawki najpierw inkubowano w 0,3% Triton X z 5% odtłuszczonym mlekiem w PBS przez 30 minut. Próbki inkubowano następnie z jednym z następujących przeciwciał pierwszorzędowych: króliczym anty-NCAM (1: 300, Chemicon Inc.), szczurzym anty-Musashi-1 (1: 200, prezent od H. Okano, Keio University, Japonia), mysz anty-Nestin (1: 300; Chemicon Inc.), mysie przeciwciało przeciwko TuJ1 (1: 300; BabCO), królicze przeciw-GFAP (1: 1000; Chemicon Inc.), mysie przeciw Map2ab (1: 250; Aldrich), króliczego anty-GalC (1: 100, Chemicon Inc.), króliczego anty-glutaminianu (1: 200, Chemicon Inc.), koziego anty-ChAT (1: 1000, Chemicon Inc.), mysiego anty-GABA ( 1: 1000, Sigma-Aldrich), mysie anty-BrdU (1: 200; BD), królicze przeciw-TH (1:60; Chemicon Inc.), królicze przeciwciała przeciw serotoninie (1: 2000; DiaSorin Inc.), lub szczurzy anty-DAT (1: 100; Chemicon Inc.) w 2% odtłuszczonym mleku w PBS przez noc w 4 ° C. Po 3 przemyciach w PBS, próbki inkubowano z odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi przez godzinę w temperaturze pokojowej: znakowane FITC przeciwciało przeciwko mysim Ig (1: 200; Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.) i anty-króliczymi Ig znakowanymi Cy3 (1: 200, Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.). Do barwienia jądrowego dodano 200 ng / ml 4p, 6a-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) w końcowym etapie przemywania. Po przepłukaniu w PBS próbki były montowane i analizowane przy użyciu laserowego mikroskopu konfokalnego FV300 firmy Fluoview (Olympus Optical Co.). W badaniach in vitro komórki w 5 losowo wybranych polach, z których każda zawierała 100 500 500 komórek, policzono dla 3 do 5 niezależnych hodowli. W badaniach in vivo liczbę immunoreaktywnych komórek określono ilościowo w co szóstej sekcji w całym przeszczepie i otaczającej tkance. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą jednokierunkowej ANOVA i wielokrotnego porównania post hoc w teście Dunna. Wartość AP mniejsza niż 0,05 została uznana za znaczącą. Ocena behawioralna. Zachowanie parkinsonowskie oceniano za pomocą skali ocen wcześniej zaproponowanej przez Akai i in. (51), z modyfikacjami (Tabela 1)
[podobne: ciekawe miejsca w czechach, jak radzić sobie ze stresem w szkole, crt d ]
[patrz też: polskie towarzystwo ginekologiczne, nakładanie żelu na paznokcie, ciasta bezglutenowe przepisy ]