Skip to content

Komórki Th22 reprezentują odrębny ludzki podzbiór komórek T związany z odpornością na naskórek i przebudową ad 8

2 miesiące ago

320 words

Pokrótce, pęcherze zostały wywołane przez wytworzenie próżni na normalnej skórze przedramion. Arkusze naskórka uzyskano z dachów blistrowych, potraktowano 0,05% trypsyną (Invitrogen), otrzymując zawiesinę pojedynczych komórek i wysiano na warstwie odżywczej napromienionych fibroblastów 3T3 / J2 w zmodyfikowanej pożywce zielonej. Przy konfluencji 70%. 80%, keratynocyty oddzielono za pomocą 0,05% trypsyny, podzielono na równe części i zamrożono w ciekłym azocie. Keratynocyty drugiego i trzeciego pasażu zastosowano w doświadczeniach. Izolacja komórek T CCR10 + i stabilność fenotypowa. Komórki T efektorowe CCR10 + wyizolowano magnetycznie z PBMC zubożonego w CD45RA za pomocą kombinacji znakowanego PE przeciwciała anty-CCR10 (R & D Systems) i mikroperełek anty-PE (Miltenyi Biotech). Komórki CCR10 + ponownie stymulowano przez 5 dni w pożywce AIMV z przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28 oraz następującymi cytokinami i przeciwciałami blokującymi: 25 ng / ml IL-12 i 5 ug / ml antyAl-4 (warunek Th1); 25 ng / ml IL-4, 5 (ig / ml antyA IL-12 i anty-IFN-y (Warunek Th2); 20 ng / ml IL-la, 20 ng / ml IL-6, 20 ng / ml IL-23, 5 ng / ml TGF-a, 5 (ig / ml antyA IL-12 i 5 ug / ml anty-IL-4 (warunek Th17); 5 ng / ml TGF-a, 5 (ig / ml antyAlL-12 i 5 ug / ml antyAl-4 (stan Treg); 50 ng / ml TNF-a, 20 ng / ml IL-6, 5 ug / ml antyAlL-12 i 5 ug / ml antyAl-4 (warunek Th22). Stymulacja keratynocytów. Łącznie 105 keratynocytów wysiewano na 6-studzienkowe płytki do mikromiareczkowania w podstawowej pożywce keratynocytowej (KBM) z suplementami (Invitrogen) przez 5 dni. W dniu stymulacji pożywkę zastąpiono KBM i KBM plus 50 ng / ml rekombinowanego TNF-a. i / lub 50 ng / ml IL-22. Alternatywnie, supernatant otrzymano z klonów Th22 stymulowanych przez 48 godzin anty-CD3 i anty-CD28 (oba BD Biosciences) i odwirowywano w celu uniknięcia skażenia komórkowego. Zawartość cytokin mierzono za pomocą ELISA. Naturalną IL-22 zobojętniono przez inkubację z 10 .g / ml antyA IL-22 (AF-782, systemy R & D) 3 godziny przed stymulacją keratynocytów. Pełne medium służyło jako kontrola negatywna. Po 12 godzinach stymulacji okresowe komórki przemyto, odłączono 0,05% trypsyną, zamrożono szokowo w ciekłym azocie i konserwowano w temperaturze <80 ° C aż do dalszej analizy. Analiza cytometrii przepływowej. Następujące przeciwciała zastosowano w analizie cytometrii przepływowej: sprzężone z FITC CD4 (klon SK3), sprzężone z PE CD4 (klon SK3), sprzężone z PE CD8 (klon SK1) i sprzężone z FITC CD56 (klon NCAM16.2), wszystkie z BD Biosciences; Sprzężona z FITC IL-4 (klon MP4-25D2), sprzężony z FITC IFN-y (klon B27) i IFN-y sprzężony z allofikocyjaniną (klon B27), wszystkie z BD Biosciences. Pharmingen; Sprzężona z PE IL-22 (klon 142928) i IL-4 sprzężona z PE (klon 3007.11), wszystkie z R & D Systems; i sprzężoną z PE IL-17A (klon SK3) z eBioscience. Wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin przeprowadzono stosując zestaw (BD Biosciences) zgodnie z instrukcjami producenta. Pokrótce, komórki stymulowano PMA i jonomycyną przez 6 godzin w obecności monenzyny. Po 2 godzinach dodano brefelinę A. Komórki utrwalono i permeabilizowano za pomocą Cytofix / Cytoperm (BD Biosciences) i inkubowano z przeciwciałami. Komórki analizowano za pomocą FACS Aria (BD Biosciences), a dane zilustrowano oprogramowaniem FlowJo (Tree Star Inc.). ELISA. Stężenia IFN-a, IL-4, IL-10, IL-17, IL-22 i TNF-a w bezkomórkowym supernatancie hodowli mierzono za pomocą dostępnych w handlu kanapkowych zestawów ELISA (wszystkie z systemów R & D). Ekstrakcja RNA, generowanie cDNA i analiza PCR w czasie rzeczywistym. Całkowity RNA wyizolowano z mrożonych peletek komórkowych za pomocą zestawu RNeasy Mini (Qiagen) i poddano odwrotnej transkrypcji losowymi heksamery- mi przy użyciu zestawu do syntezy cDNA First Strand (Fermentas) zgodnie z protokołami producenta. Startery do PCR w czasie rzeczywistym, zaprojektowane za pomocą oprogramowania Primer Express (wersja 1.2, Applied Biosystems), wymieniono w Tabeli dodatkowej 2. PCR przeprowadzono na 384-studzienkowych płytkach przy użyciu EP Motion 5075 (Eppendorf) do pipetowania wszystkich odczynników. CDNA amplifikowano za pomocą SYBR Green Mastermix (Applied Biosystems) w ABI Prism 7000HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). Porównawczą metodę Ct zastosowano do obliczenia względnej kwantyfikacji i zakresu ufności. Analiza mikromacierzy całego genomu. Jakość i integralność próbek RNA sprawdzono za pomocą platformy Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies); 0,5 .g każdej próbki całkowitego RNA amplifikowano i znakowano Cy3 za pomocą zestawu liniowego Amp Kit Agilent Low RNA (Agilent Technologies) zgodnie z protokołem producenta. Procedurę hybrydyzacji przeprowadzono zgodnie z protokołem przetwarzania mikromacierzy z oligo Agilent 60-mer, stosując zestaw do hybrydyzacji Agilent Gene Expression i Agilent Whole Human Genome Oligo Microarrays 4x44K (Agilent Technologies). [więcej w: crt p, nakładanie żelu na paznokcie, crt d ] [patrz też: nadpobudliwość psychoruchowa u dzieci, wrzodziejące zapalenie jelita grubego objawy, maseczka z siemienia lnianego na włosy ]