Skip to content

Degradacja histonowej deacetylazy i aktywacja MEF2 sprzyjają powstawaniu wolnych mięśni mięśniaków ad 8

2 miesiące ago

687 words

Myc-NLS-HDAC5 był miłym prezentem od Tima McKinsey a. Mutacja punktowa K270R została wygenerowana przez ukierunkowaną mutagenezę (Stratagene). Transgeniczne konstrukty Myo-tTA i Myo-MEF2C-VP16 wygenerowano przez klonowanie kasety tTA z wektora pUDH 15-1 (43), łącząc domenę aktywującą VP16 w ramce z C-końca MEF2C o pełnej długości, i klonowanie. wprowadzić je do miejsca HindIII wektora pBSIISK (+) zawierającego ogon hGHpolyA. Promotor miogeniny / wzmacniacz MEF2C (22) został następnie sklonowany powyżej kaset do miejsc KpnI / XhoI. Myoblasty C2C12 hodowano w DMEM uzupełnionym płodową surowicą bydlęcą i antybiotykami (100 U / ml penicyliny i 100 ug / ml streptomycyny). W celu przejściowych testów transfekcji komórki wysiewano i transfekowano 12 godzin później przy użyciu FuGENE (Roche Applied Science) zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki zebrano 24-48 godzin po transfekcji. Stabilne linie C2C12 eksprymujące znakowany FLAG HDAC5 lub FLAG-znakowany HDAC5S / A zostały ustalone przez selekcję G418 klonów C2C12 transfekowanych plazmidami kodującymi WT HDAC5 lub odpornym na CaMK mutantem HDAC5, w którym Ser259 i Ser498 zmutowano w alaniny (13). Komórki traktowano cykloheksymidem (Sigma-Aldrich) i / lub MG132 (Calbiochem; EMD Biosciences) we wskazanych stężeniach. Wytwarzanie myszy transgenicznych i myszy z nokautem. Myszy transgeniczne, które eksprymują konstytutywnie aktywne formy kalcyneuryny lub CaMKIV pod kontrolą wzmacniacza specyficznego względem mięśnia z genu kinazy kreatynowej mięśnia (MCK) opisano w innym miejscu (17, 18). Transgeniczne myszy Tet-HDAC5S / A opisano gdzie indziej (23). Myszy transgeniczne Myo-tTA, tet-lacZ i Myo-MEF2C-VP16 wytworzono przez wstrzyknięcie zlinearyzowanych konstruktów do przedjądrzy zapłodnionych komórek jajowych, jak opisano wcześniej (44). Hdac5. /. (15), Hdac9. /. (19), a myszy warunkowego nokautu Hdac7 zostały wcześniej wygenerowane (21). Myszy warunkowe Hdac4 wytworzono przez flankujące eksonu 6 miejsca loxP, co skutkowało mutacją poza ramką w allelu Hdac4. Mef2a. /. oraz myszy z mutacją warunkową Mef2c i Mef2d zostały opisane wcześniej (24, 45). Prawidłowe ukierunkowanie genów zostało potwierdzone przez analizę Southern blot, sekwencjonowanie genomowe i RT-PCR. Immunoprecypitacja i immunoblot. Immunoprecypitacje przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (20). Przeciwciała przeciw HA (1: 1000, Sigma-Aldrich), FLAG M2 (1: 4 000, Sigma-Aldrich), Myc (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology Inc.), (3-tubulina (1: 5000, Sigma-Aldrich) , HDAC1, -2 i -3 (1: 1000 dla wszystkich, Sigma-Aldrich), HDAC4 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology Inc.), HDAC5 (1: 1000, Millipore), HDAC7 (1: 1000; Technologia sygnalizacji), MEF2A (1: 1000, Millipore), MEF2C (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology Inc.), MEF2D (1: 2500, BD Biosciences), troponina I powolna (1: 2500, Santa Cruz Biotechnology Inc.) Cytochrom c (1: 2500, BD Biosciences Pharminggen) i mioglobinę (1: 3000, Dako) zastosowano do analizy immunoblotów. Do analizy endogennych białek HDAC klasy II zastosowano zestaw do wykrywania ECL Advance Western Blotting Detection (Amersham Biosciences). Badania farmakologiczne in vivo. Myszy transgeniczne Myo-tTA i tet-HDAC5S / A hodowano podczas odbierania DOX (200 .g / ml) w wodzie, jak opisano wcześniej (23). Myszy transgeniczne Myo-tTA et-HDAC5S / A utrzymywano w DOX w razie potrzeby. Przeprowadzono dobrowolne eksperymenty na kołach i zmierzono je jak opisano wcześniej (12). Zwierzętom pozwolono przyzwyczaić się do biegających klatek przez 4 dni przed rozpoczęciem nagrywania. DOX usunięto z myszy w dniach aklimatyzacji, aby zwierzęta mogły rozpocząć ekspresję transgenu. Po 4 dniach aktywność ściernicy mierzono w sposób ciągły przez 4 tygodnie. Wymuszone ćwiczenia wysiłkowe na bieżni do analizy transgenicznych myszy Myo-MEF2C-VP16 przeprowadzono w następujący sposób. Przed ćwiczeniem myszy były przyzwyczajone do bieżni (Columbus Instruments) z 5-minutową próbą przy 7 m / min raz dziennie przez 2 dni. Test wysiłkowy przeprowadzono na 10% nachyleniu dla 10 m / min przez pierwsze 60 minut, następnie zwiększano przyrost o m / min dla 3- do 15-minutowych interwałów, następnie 45 minut przy 13 m / min, a następnie Wzrost m / min zwiększa się w 15-minutowych odstępach do wyczerpania. Przymusowe ćwiczenia zakończyły się, gdy myszy nie były w stanie uniknąć powtarzających się wstrząsów elektrycznych. Myszy reporterowe MEF2 (DesMEF lacZ) prowadzono przez około 3 godziny przy 9 m / min. Eksperymenty hamowania proteasomu in vivo prowadzono przez dootrzewnowe dostarczanie DMSO lub MG132, jak opisano wcześniej przez 6 godzin (27), z tym wyjątkiem, że do wstrzyknięć użyto 30 mg / kg masy ciała MG132.
[więcej w: kalendarzyk miesiączkowy ob, badania elektrofizjologiczne, kardiolog blog ]
[podobne: kalendarzyk miesiączkowy ob, przeciwwskazania do mikrodermabrazji, diukowie hazzardu cda ]