Skip to content

Degradacja histonowej deacetylazy i aktywacja MEF2 sprzyjają powstawaniu wolnych mięśni mięśniaków ad 5

2 miesiące ago

788 words

Odkrycia te dowodzą, że MEF2 jest wystarczający do przeprowadzenia szybkiej transformacji w kierunku wolnych włókien, naśladując efekt ćwiczeń in vivo. Figura 4 Aktywowana MEF2 jest wystarczająca do zwiększenia ekspresji wolnych włókien. (A) Analiza Western blot ekspresji transgenu Myo-MEF2C-VP16 z użyciem przeciwciała anty-VP16. Ekspresja wolno-włóknistej specyficznej troponiny I i markerów utleniających mioglobiny i cytochromu c w ekstrakcie białka mięśni GP myszy transgenicznych myszy Myo-MEF2C-VP16. (B) Barwienie Metachromatic ATPazą mięśni brzuchatego łydki i PLA myszy transgenicznych WT i Myo-MEF2C-VP16. Oryginalne powiększenie, × 4. Pasek skali: 300 .m. Przerywane czerwone linie wyznaczają mięśnie brzuchatego łydki z PLA. (C i D) Wytrzymałość wysiłkową i sprawność mięśni pokazującą całkowity czas pracy (min; C) i całkowity przebieg odległości (m; D) transgenicznych mięśni Myo-MEF2-VP16 analizowano za pomocą wymuszonego ćwiczenia na bieżni. Osiem tygodni myszy Myszy transgenicznej Myo-MEF2C-VP16 i myszy WT o podobnych ciężarach ciała poddano przymusowemu ćwiczeniu na bieżni (n = 5 dla każdej grupy) na 10% nachylenia. Aby zbadać funkcjonalne konsekwencje wzrostu wolnych włókien i zdolności oksydacyjnych transgenicznych mięśni Myo-MEF2C-VP16, zmierzono wytrzymałość tych myszy przez wymuszone ćwiczenie na bieżni z 10% nachylenia. Jak pokazano na Fig. 4, C i D, myszy transgeniczne Myo-MEF2C-VP16 wykazywały 75% wzrost czasu działania i odpowiednio 94% wzrostu odległości w porównaniu z myszami WT. Zatem aktywacja MEF2 jest wystarczająca do zwiększenia zdolności oksydacyjnej mięśni szkieletowych i zawartości mitochondriów, a tym samym do zmniejszenia zdolności do męczenia mięśni i zwiększania wytrzymałości. HDAC klasy II są ubikwitynowane i rozkładane przez proteasomy. Aby zacząć rozumieć mechanistyczną podstawę dla braku akumulacji białek HDAC klasy II w wolnych włóknach mięśni szkieletowych, zbadaliśmy okres półtrwania HDAC5 in vitro przy użyciu stabilnej linii komórek mięśniowych C2C12, które konstytutywnie eksprymowały znakowany FLAG HDAC5. Zahamowanie syntezy białka cykloheksymidem przez 4 godziny spowodowało gwałtowny spadek poziomu białka HDAC5 w miocytach szkieletowych (Figura 5A). Przeciwnie, .-tubulina była stabilna w tym okresie czasu. Inhibitor proteasomu MG132 blokował degradację HDAC5 (Figura 5B), co sugeruje, że HDAC5 jest degradowany przez drogę proteasomu. Figura 5 Kwabiotynacja i degradacja HDAC klasy II in vitro i in vivo. (A) Komórki C2C12 trwale eksprymujące znakowany FLAG HDAC5 (C2C12-HDAC5) traktowano cykloheksymidem (CHX, 25 | jM) przez 0, 1, 2 lub 4 godziny przed lizą komórek i mierzono ekspresję FLAG-HDAC5 przez Western analiza blot przy użyciu przeciwciała anty-FLAG M2. Badanie immunologiczne tubuliny wykazało równoważne obciążenie każdej ścieżki. (B) Komórki C2C12-HDAC5 traktowano cykloheksymidem i MG132, pojedynczo lub w połączeniu przez 4 godziny, i analizowano ekspresję FLAG-HDAC5. (C) Komórki C2C12-HDAC5 i C2C12 trwale eksprymujące HDAC5 oporny na CaMK (S259 / 498A) transfekowano ubikwityną znakowaną HA (HA-Ub) i bez niej i traktowano z lub bez MG-132 (25 | jM) przez 4 godziny. ; zanotowano status ubikwitynacyjny WT i zmutowanej HDAC5. Wyrażenie FLAG na wejściach pokazuje równe obciążenie. (D) Subkomórkowa lokalizacja Myc-HDAC5 (WT), Myc-HDAC5 (K270R) lub Myc-SV40 NLS-HDAC5 (K270R) w komórkach C2C12. (E) Analizowano status ubikwitynacyjny cytoplazmatycznego HDAC5 [Myc-HDAC5 (K270R)] lub jądrowego HDAC5 [Myc-SV40 NLS-HDAC5 (K270R)]. (F i G) WT C57BL / 6 mężczyzn (w wieku 8 tygodni) wstrzyknięto IP z DMSO lub MG132 przez 6 godzin. Białko wyizolowano z mięśni SOL, GP, piszczelowej przedniej (TA) i EDL i analizowano pod kątem ekspresji (F) HDAC4 lub (G) HDAC5. Tubulina wykazuje równe obciążenie. (H) Leczenie MG132 zmniejsza aktywację MEF2. Sześć godzin po tym, jak myszy DesMEF-lacZ wstrzyknięto DMSO lub MG132, myszy przepuszczano przez około 3 godziny, stosując wymuszone ćwiczenia na bieżni. Następnie mięśnie szkieletowe izolowano od myszy DesMEF traktowanych DMSO i MG132 i analizowano pod kątem ekspresji lacZ. Ekspresję LacZ zmniejszono w mięśniach traktowanych MG132 (gdzie zwiększono ekspresję HDAC klasy II). Ponieważ ubikwitynacja jest warunkiem wstępnym degradacji przez proteasom (26), zbadaliśmy, czy HDAC5 był ubikwitynowany. Rzeczywiście, ubikwitynowany HDAC5 był łatwo wykrywalny, gdy ubikwityna znakowana HA była eksprymowana w linii komórkowej wyrażającej HDAC5 w obecności MG132 (Figura 5C). Odporny na sygnały mutant HDAC5S / A (13), pozbawiony miejsc fosforylacji regulacyjnej (seryny 259 i 498), był ubikwitynowany w takim samym stopniu jak białko WT HDAC5 (Figura 5C), co wskazuje, że fosforylacja HDAC5 na tych resztach nie jest warunek wstępny do ubikwitynacji
[hasła pokrewne: kalendarzyk miesiączkowy ob, outlet szczecin godziny otwarcia, badanie elektrofizjologiczne ]
[podobne: wrzodziejące zapalenie jelita grubego objawy, maseczka z siemienia lnianego na włosy, badanie elektrofizjologiczne ]